武汉新型冠状病毒肺炎确诊,到底难在哪儿

从目前疫情汇总情况看,武汉仍有大量的疑似新型冠状病毒肺炎确诊艰难。根据1月23日武汉市卫生健康委员会针对新型冠状病毒肺炎防控情况的介绍,此前,疑似病例样本“由辖区疾控中心转运到武汉市疾控中心,武汉市疾控中心转运到湖北省疾控中心进行核酸检测,每天可检测样本200多份”。

每天检测200多份样品,显然无法满足不断涌入医院的发热病人确诊需求。由于核酸检测是新型冠状病毒肺炎确诊的最关键步骤,因此核酸检测的效率似乎成为新型肺炎确诊效率的瓶颈

那么,武汉新型冠状病毒肺炎核酸检测为什么这么难?

太长不看:

新型冠状病毒核酸检测需使用的荧光PCR法耗时较长,对实验室、设备、人员均有要求。

指定检测机构和资源分配是目前的瓶颈。

确诊难的情况有望随试剂盒快速审批得到缓解。

PCR:把微量遗传物质复制扩大

目前采用的新型冠状病毒核酸检测方法叫做荧光PCR法,这是一项有着几十年历史的成熟的分子生物学技术。PCR全称为Polymerase Chain Reaction,中文翻译为“聚合酶链式反应”。早在1983年,美国Cetus公司的穆利斯( Kary Mullis)首先提出设想,并在1985年发展出现在的PCR技术。1993年,穆利斯因发明PCR技术获得诺贝尔化学奖。

新冠状病毒核酸检测试剂盒(即荧光PCR法)

众所周知,生物体的遗传物质是DNA和RNA。大多数生物的遗传物质是双链DNA分子,而某些RNA病毒的遗传物质则是RNA,例如这次新冠状病毒就是RNA病毒。

在人类的生命周期中,细胞中1条双链DNA分子可以在DNA聚合酶(即PCR中的“P”)的作用下复制成2条一模一样的双链DNA分子,即获得2个拷贝数。PCR技术就是在试管中模拟DNA在细胞中的复制过程,将微量的DNA分子进行多次循环的复制,使得最初极为微量的DNA分子获得大量的拷贝数,这样可以对获得的DNA分子进行比对和检测。

针对遗传物质是RNA的病毒,可以先将RNA提取出来,用酶把RNA序列转换成DNA分子,然后对得到的这些DNA分子进行多次循环复制,即PCR反应。

图 | pixabay

荧光PCR技术出现于1996年,在原有技术的基础上,通过荧光染料或荧光探针来指示DNA复制的拷贝数,通过相应的软件分析荧光信号,计算样品中初始核酸分子的含量。荧光PCR技术相比原来常规PCR,可以更加精确地定量测定生物样本中的核酸含量,目前成为病毒核酸检测的常规方法之一

新冠状病毒核酸检测试剂盒就是通过荧光PCR技术,检测病人肺泡灌洗液、咽拭子、血液等样本中新冠状病毒核酸的含量,如果核酸含量超过某个临界值(即阳性结果),则认为该病人被新冠状病毒感染;如果样本中核酸含量低于某个临界值(即阴性结果),则认为该病人没有被该病毒感染。

试剂盒诞生迅速

要对新冠状病毒进行核酸检测,首先要获得新冠状病毒的遗传物质RNA全基因组序列信息。

在获得患者标本12天后,上海市公共卫生临床中心于2020年1月7日在实验室检出一种新型冠状病毒,并获得了其全基因组序列。

之后,便可以设计并人工合成PCR所需要的“引物”(一小段DNA分子,用于启动DNA复制)和荧光探针,对病人的生物样本进行核酸测试。经过在实验室中对荧光PCR实验条件的优化、测试和验证,确保试剂盒的准确性和精确性,避免出现误诊(假阳性)和漏诊(假阴性),便可获得用于临床诊断的标准化新冠状病毒核酸检测试剂盒。

据报道,三家已经通过国家疾控中心认证的试剂盒生产企业(辉睿生物、捷诺生物和伯杰医疗)迅速投入生产,仅捷诺生物一家就在1月16日生产了可供7.5万人份使用的试剂盒

从分离病原体、鉴定新冠状病毒、获得全基因组序列、研发核酸检测(荧光PCR)试剂盒,到试剂盒的投入生产,只用了不到一个月,这个反应速度是非常快的。

新型冠状病毒的电镜照片 | 中国疾控中心

检测要素:实验室、仪器、人员

不过,相对于一些常规临床检测(比如血常规只有半个小时),荧光PCR测试花费的时间要长得多。

在进行荧光PCR测试之前,先要从病人的生物样本(肺泡灌洗液、咽拭子、血液等)中提取病毒核酸。一般核酸提取仪所需时间从半小时到2小时不等,一次可提取的样本通量从32个到96个不等。荧光PCR测试需在荧光PCR仪器上进行,通常需要2个小时左右。

一台荧光PCR仪器通常一次可以测试96个样本,由于测试时需要做阳性对照和阴性对照用于检测的质量控制,因此一般一台荧光PCR仪器一次最多可以检测88个样本。加上试剂的准备、上样等操作时间,一轮荧光PCR测试差不多需要5个小时,之后结果分析和出检测报告还需要时间。因此从病人样本送到实验室即刻开始测试到出检测报告差不多也需要8个小时

一台PCR仪24小时不停歇轮3班,每班配一个检测实验员,每班最多88个样本,24小时只能检测200多个样本。这其中还可能出现首次检测结果模棱两可(介于阳性和阴性之间的结果)需要复检的样本。

每班最多88个样本 | 图虫

由于新冠状病毒属于传染性较强的病毒,为了防止测试过程中发生病毒泄露或人员感染等生物安全事件,这类病毒的核酸检测实验室还必须达到至少二级生物安全实验室级别,同时采用生物安全三级实验室的个人防护,操作人员也必须是经过专业训练的检测员。

因此符合条件的实验室数量、荧光PCR仪器数量、操作人员的数量成为决定新冠状病毒核酸检测效率的重要因素

不过,三甲医院一般都有病毒核酸检测实验室,还有一些第三方检测机构也有相应资质的病毒核酸检测实验室,因此应该也是有能力进行检测的。

那么目前确诊效率的瓶颈在哪里呢?

指定检测机构和资源分配效率成瓶颈

1月23日武汉市卫生健康委员会官方网站发布的信息提到,根据当时病例样本的检测流程,新冠状病毒核酸检测暂时只能在湖北省疾控中心进行,但疾控中心的实验设备、测试人员有限,每天可检测的样本数量远远不能满足武汉疑似病例的确诊需求。

官网信息还提到,从1月22日开始,武汉市已指定各定点救治医院、发热定点诊疗医院的对口帮扶医院以及市疾控中心等具备相应防护级别的生物安全实验室开展相关样本的新冠状病毒核酸检测工作。第一批指定检测机构共10家,如果全部运行起来,预计每天可检测样本近2000份。国家卫健委下发的通知也提及,各省可以购买服务的方式,与具备条件的第三方检测机构合作开展检测。

问题在于,虽然上述获得国家疾控中心认证的三家企业已经生产了大量核酸检测试剂盒,但是由于时间紧急,它们暂时并没有获得国家药监局的上市批件医院和第三方测试机构暂时不能自行采购试剂盒进行检测目前只能由各省市疾控中心统一采购分发到指定检测机构。武汉市计划紧急调运3万人份试剂盒发放到指定检测机构,目前已下发6000人份。

根据1月25日界面新闻最新报道,已有7家企业研发的新型冠状病毒核酸检测试剂盒进入了国家药监局快速审批通道,有望很快拿到国家药监局的上市批件。

如果过程顺利,随后由疾控中心指定的具备检测资格的医院和第三方测试机构就可以自行采购新冠状病毒核酸检测试剂盒进行测试,这样无论是资源分配效率还是检测效率都将大大提高,武汉新型冠状病毒肺炎确诊艰难的状况应该会得到缓解。

作者:DNA

编辑:odette

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